Pengenalan kepada 'DNA Sequencing'
oleh ibadurrahman
 |
| Apakah alat ini?[1] (c) Gambar hakmilik Oxford Nanopore Technologies |
Penjujukan DNA merupakan proses penentuan susunan nukelotida dengan tepat yang terkandung di dalam DNA. Ianya meliputi berbagai kaedah serta teknologi bagi menentukan susunan empat bes iaitu, adenine, guanine cytosine dan thymine di dalam seurat bebenang DNA. Kemunculan kaedah penjujukan DNA secara pantas telah banyak memacu penyelidikan biologi, perubatan dan penemuan-penemuan baharu.
Keutamaan Kemahiran Penjujukan DNA
Pengetahuan tentang penjujukan DNA telah menjadi suatu perkara yang sangat diperlukan di dalam penyelidikan biologi asas, serta beberapa bidang gunaan seperti diagnosis perubatan, bioteknologi, biologi forensik, virologi dan sistematik biologi. Kepantasan penjujukan DNA telah menjadi alatan penting dalam menjujuk seluruh DNA atau genom (beberapa jenis spesis, termasuk genom manusia).
Kaedah Awal Penjujukan DNA
Jujukan DNA pertama kali diperoleh pada awal 1970-an oleh penyelidik dengan menggunakan kaedah makmal yang berasaskan kromatografi dwi-dimensi. Setelah kaedah berasaskan fluorescence (istilah Dewan Bahasa: pendaflour) terautomatik diperkenalkan, penjujukan DNA dapat dilakukan dengan lebih pantas.
 |
| Syarikat Oxford Nanopore telah sampai kepada mesin penjujukan DNA bersaiz pemacu USB yang mampu menterjemahkan blok binaan kehidupan dalam masa beberapa jam. Gambar menunjukkan genom manusia. Hak milik (c) theguardian.uk |
Kegunaan Penjujukan DNA
Penjujukan DNA digunakan untuk menentukan urutan gen perseorangan, kawasan genetik lebih besar (gugusan gen atau operon), kromosom penuh atau keseluruhan genom. Penjujukan menyediakan susunan nukleotida individual yang terdapat dalam DNA atau RNA yang telah diasingkan dari haiwan, tumbuh-tumbuhan, bakteria, archaea, atau apa-apa sumber maklumat genetik.
1) Kegunaan dalam biologi molekular
Penjujukan digunakan untuk mengkaji genom dan protein yang ia kodkan. Maklumat yang diperoleh melalui penjujukan membolehkan para penyelidik mengenalpasti perubahan pada gen, perkaitan dengan penyakit serta fenotip, dan menentukan sasaran ubat yang paling berpotensi.
2) Kegunaan dalam biologi evolusi
Penjujukan DNA digunakan untuk mengkaji sejauhmana organisma itu berbeza dengan lainnya dalam hubungkait antaranya serta bagaimana mereka berevolusi.
3) Metagenomik
Bidang metagenomik melibatkan penentuan organisma yang hadir di dalam air, kumbahan, kotoran atau serpihan yang ditapis dari udara, atau sample yang dicebis dari organisma. Mengetahui jenis organisma di dalam ekologi berkenaan sangat penting dalam penyelidikan ekologi, epidemiologi, mikrobiologi dan sebagainya.
4) Perubatan
Ahli teknikal perubatan mungkin sekali menjujukkan gen (atau secara teorinya, genom penuh) dari pesakit (manusia) untuk menentukan risiko penyakit keturunan. Hal ini merupakan satu bentuk pengujian gen, walaubagaimanapun pengujian gen tidak semestinya memerlukan penjujukan gen.
5) Forensik
Penjujukan DNA digunakan bersama-sama perentasan DNA (DNA profiling) untuk pengujian forensik dan pengujian pertalian keluarga.
Sejarah Teknologi Penjujukan DNA
1) Penjujukan RNA
Dengan penemuan struktur DNA sebagai dwi-heliks pada 1953, telah berlalu bertahun-tahun sebelum DNA dapat dianalisis strukturnya dengan kaedah makmal yang mempunyai kredibiliti. Penjujukan RNA merupakan salah satu bentuk penjujukan nukleotida terawal. Peristiwa terpenting dalam teknologi ini adalah dengan berhasilnya penjujukan RNA gen lengkap dan genom lengkap bakteriofaj MS2 yang ditemui oleh Walter Fiers dari University of Ghent, Belgium pada 1972 dan 1976.
2) Kaedah Penjujukan DNA terdahulu
Kaedah pertama dalam penentuan urutan DNA melibatkan pemanjangan primer khusus-lokasi (location-specific) yang dibangunkan oleh Ray Wu dari Universiti Cornell pada 1970. Katalisis DNA polymerase dan pelabelan khusus nukleotida digunakan untuk menentukan hujung melekat (cohesive end) DNA-lambda faj (phage). Di antara 1970 hingga 1973, Wu dan Padmabhan dan rakan-rakan mereka telah mendemonstrasikan bahawa kaedah ini dapat dilaksanakan untuk menentukan sebarang urutan DNA dengan menggunakan primer khusus-lokasi sintetik. Frederick Sanger kemudiannya mengambil idea ini (strategi pemanjangan primer) untuk menghasilkan kaedah penjujukan DNA yang lebih pantas dan beliau telah menerbitkan kaedahnya 'DNA sequencing with chain-terminating inhibitor' (Penjujukan DNA dengan perencat penghapus-rantaian) pada 1977.[Untuk membaca artikel yang diterbitkan, sila klik di sini, untuk membaca terjemahan artikel sila klik sini (pautan belum tersedia)] Walter Gilbert dan Allan Maxam dari Harvard turut mengemukakan kaedah penjujukan 'DNA sequencing by chemical degradation' (Penjujukan DNA melalui penguraian kimiawi). Pada 1973, Gilbert dan Maxam telah melaporkan urutan 24 pasangan-bes ditentukan dengan menggunakan analisis 'wandering-spot'. Kepesatan penjujukan DNA dibantu dengan kepesatan teknologi rekombinan DNA yang berlaku serentak telah membolehkan sampel DNA dapat diasingkan dari sumber selain daripada virus.
Penjujukan Genom Lengkap
DNA genom pertama dijujukkan adalah bakteriofaj ΦX174 (dibaca phi X174) pada 1977. Saintis dari Medical Research Council telah menterjemahkan urutan DNA lengkap virus Epstein-Barr pada 1984 dengan dapatan 170 ribu panjang pasangan-bes.
Suatu kaedah tanpa-radioaktif untuk memindahkan molekul DNA campuran jujukan (sequence mixture) ke dalam matriks tak-imobilisasi semasa elektroforesis telah dibangunkan oleh Pohl dan rakan-rakannya pada 80-an. Berikutan pengkomersilan penjujuk DNA 'Direct Blotting Electrophoresis System GATC 1500' oleh pengeluar GATC Biotech, yang mana digunkan secara meluas di dalam rangka kerja program penjujukan genom Kesatuan Eropah, urutan DNA lengkap Saccharomyces cerevisiae kromosom II dihasilkan. Makmal Leroy E. Hoods, California Institute Technology telah mengumumkan mesin jujukan separa-automatik pertama pada 1986. Hal ini diikuti dengan penjualan mesin automatik penuh oleh Applied Biosystem, ABI370 pada 1987 yang menggunakan teknik pelabelan novel membolehkan 4 deoksinukleotida dikenalpasti pada lorong yang sama. Pada 1990-an Institut Kesihatan Nasional Amerika Syarikat telah memulakan percubaan penjujukan pada Mycoplasma capricolum, Escherichia coli, dan Saccharomyces cerevisiae pada kos US $0.75 bagi setiap pasang-bes.
Sementara itu, penjujukan cDNA manusia telah dimulai oleh makmal Craig Venter, suatu percubaan untuk menangkap bahagian yang mengkod dalam genom manusia. Pada 1995, Venter, Hamilton Smith dan rakan-rakan di Institut Kajian Genom telah menerbitkan genom lengkap organisma hidup-bebas, bakterium Haemophilus influenzae. Kromosm bulat itu mengandungi 1,830,137 bes dan penerbitan kaedah ini telah menjadi batu asas penggunaan penjujukan 'whole genome shotgun' menggantikan usaha awal pemetaan.
Kaedah Penjujukan Generasi Hadapan
Beberapa kaedah baharu penjujukan DNA telah dibangunkan pada pertengahan 1990-an dan digunakan oleh alat penjujuk DNA komersil pada tahun 2000. Pada Oktober 26, 1990, Roger Tsien dan rakan-rakannya telah memfailkan paten menerangkan tatacara jujukan 'bes-ke-bes' dengan blockers 3' yang boleh dibuang pada jajaran DNA. Pada 1996, Pal Nyren bersama pelajarnya, Moustafa Ronaghi menerbitkan kaedah mereka yang dinamai 'pyrosequencing'.
Pada 1997, Pascal Mayer dan Laurent Farrinelli telah menghantar paten kepada Pertubuhan Harta Intelek Dunia menerangkan penjujukan koloni DNA. Penyediaan sampel DNA dan kaedah penjajaran DNA rawak telah diperincikan di dalam paten berkenaan. Kaedah ini, bersama-sama kaedah yang diperkenalkan Roger Tsien 'bes-ke-bes' kini telah digunapakai di dalam penjujuk genome oleh pengeluar Illumina, Hi-Seq.
Lynx Therapeutics telah menerbitkan dan telah memasarkan MPSS atau 'Massively parallel signature sequencing' pada tahun 2000 yang telah menjadi penjujuk generasi hadapan pertama, walaupun ia tidak dijual pada makmal-makmal bebas. Pada 2004, 454 Life Sciences telah memasarkan pyrosequence versi sejanjang yang mengurangkan kos jujukan berbanding jujukan Sanger merangkap jujukan generasi hadapan kedua selepas MPSS.
Jumlah data yang besar terhasil dari penjujukan DNA turut memerlukan pembangunan kaedah baharu dan program untuk menganalisa urutan. Phil Green dan Brent Ewing dari Universiti Washington mengusulkan 'phred quality score' mereka untuk penjujuk analisis pada tahun 1998.
Kaedah Asas Penjujukan DNA
1) Penjujukan Maxam-Gilbert
Allan Maxam dan Walter Gilbert telah menerbitkan sebuah kaedah penjujukan DNA pada 1977 berdasarkan pengubahsuaian kimia DNA dan beberapa turutan potongan pada bes-bes yang khusus. Turut dikenal sebagai penjujukan kimia, kaedah ini membolehkan sampel DNA dwi-benang yang telah dimurnikan digunapakai tanpa perlu mengalami pengklonan seterusnya. Kaedah ini menggunakan pelabelan radioaktif dan kerumitan teknikalitinya menyebabkan ia tidak lagi dipraktikkan setelah pemansuhan dibuat melalui teknik Sanger. Teknik Maxam memerlukan pelabelan radioaktif pada salah satu hujung 5' DNA dan pemurnian segmen DNA itu dijujukkan. Proses kimia kemudiannya menghasilkan bukaan pada sudut kecil satu atau dua dari 4 bes nukleotida dalam setiap 4 tindakbalas berkenaan (G, A+G, C, C+T). Kepekatan kimia penggubah dikawal untuk menghasilkan purata 1 pengubahsuaian per molekul DNA. Jadi, satu siri fragmen yang berlabel telah dihasilkan daripada hujung radio-label kepada tempat 'potongan' pertama tiap-tiap molekul. Fragmen dari keempat-empat tindakbalas dielektroforesiskan sebelah-menyebelah di dalam gel acrylamide nyahasli untuk pengasingan mengikut saiz. Untuk menvisualisasi fragmen-fragmen tersebut, gel didedahkan kepada filem sinaran-X atau autoradiografi yang akan menghasilkan garis-garis gelap yang tiap satunya merujuk kepada DNA terlabel radioaktif. [Untuk membaca terjemahan artikel Maxam-Gilbert sila klik sini]
2) Kaedah Pemusnahan Rantaian
Kaedah pemusnahan rantaian (Chain termination method) dibangunkan oleh Frederick Sanger dan rakan-rakannya pada 1977, kemudiannya telah menjadi kaedah pilihan, disebabkan kemudahan pengendaliannya dan kebolehpercayaannya. Semasa penciptaannya, kaedah pemusnahan rantaian menggunakan bahan kimia toksik dalam jumlah yang lebih sedikit dan kurang bilangan radioaktiviti berbanding kaedah Maxam-Gilbert. Kaedah Sanger kemudiannya diautomasikan dan menjadi generasi pertama dalam kalangan penjujuk DNA. Penjujukan Sanger merupakan kaedah yang bertahan dari tahun 80-an hingga pertengahan 2000-an. Di sepanjang tempoh itu, berlaku pelbagai pembaharuan dan penambahbaikan kepada kaedah penjujukan antaranya pelabelan fluorescent, elektroforesis kapilari dan automasi umum. Pembangunan ini menambahbaik tahap keberkesanan jujukan justeru, mengurangkan kos operasi. Kaedah Sanger, di dalam bentuk penghasilan besar-besaran merupakan teknologi yang menghasilkan genom manusia pertama pada tahun 2001. Walaubagaimanapun, puluhan tahun kemudiannya, kaedah-kaedah yang menggunakan pendekatan yang berbeza dan radikal telah masuk ke dalam pasaran, membawa kepada penurunan kos per genom $100 million pada 2001 kepada $10,000 pada tahun 2011.
Kaedah Canggih & Terkehadapan dan Penjujukan de novo
Penjujukan skala besar seringkali menyasarkan penjujukan cebisan DNA yang sangat panjang, umpamanya keseluruhan kromosom walaupun penjujukan skala besar juga boleh digunakan untuk menghasilkan urutan pendek yang begitu banyak seperti yang dijumpai dalam 'phage display'. Bagi sasaran yang lebih panjang seperti kromosom, pendekatan biasa yang terdiri daripada pemotongan (dengan enzim restriksi) atau pengoyakan (dengan daya mekanikal) fragmen besar DNA kepada fragmen yang lebih kecil. Fragmen DNA yang telah dipecahkan kemudiannya diklonkan ke dalam vektor DNA dan digandakan di dalam hos bakteria seperti E.coli. Fragmen DNA pendek yang dimurnikan daripada koloni bakteria dijujukkan secara individual dan disusun-pasang secara elektronik menjadi suatu urutan yang panjang. Kajian mendapati bahawa dengan menambah langkah pemilihan saiz untuk mengumpul fragmen DNA yang memiliki saiz yang seragam dapat memperbaiki keberkesanan penjujukan dan ketepatan susun-pasang genom. Dalam kajian tersebut, automasi pensaizan telah dibuktikan lebih baik dari sudut keboleh-hasilan semula dan kejituannya berbanding pensaizan manual gel.
Perkataan 'penjujukan de novo' secara khususnya merujuk kepada kaedah yang digunakan untuk menentukan urutan DNA yang belum pernah diketahui urutannya. De novo berasal daripada bahasa Latin yang dapat diterjemahkan sebagai 'dari permulaan'. Ruang kosong (lompong) yang berada urutan yang telah disusun-pasang akan diisikan oleh perjalanan primer. Strategi yang berbeza memiliki imbal-tukar (trade off) yang berbeza dari sudut kepantasan dan kejituan; kaedah shotgun selalunya diguna untuk menjujuk genom besar, akan tetapi pemasangannya adalah kompleks dan rumit, terutamanya apabila melibatkan ulangan urutan, seringkali menyebabkan lompong dalam susun-pasang genom.
Kebanyakan pendekatan penjujukan menggunakan langkah pengklonan in vitro bagi memperbanyak molekul DNA individual, disebabkan kaedah pengesanan molekularnya tidak cukup sensitif buat penjujukan molekul tunggal. Emulsi PCR mengasingkan molekul DNA individual bersama-sama dengan manik bersalut-primer di dalam titisan aqueous dalam fasa minyak (oil phase). PCR kemudiannya menyalut setiap manik dengan salinan klonal molekul DNA diikuti dengan imobilisasi bagi jujukan kemudiannya. Emulsi PCR yang digunakan ini merupakan rekaan Margulis et al. (yang dikomersilkan oleh 454 Life Sciences), Shendure dan Porreca et al. (turut dikenali sebagai "Penjujukan Polony") dan penjujukan SOLiD, (dibangunkan oleh Agencourt, kemudiannya Applied Biosystem dan kini, Life Technologies).
... ... ... ...
[1] minION(tm); Percaya atau tidak, Oxford Nanopore sedang membangunkan alat penjujukan DNA bersaiz poket. Adakah alat ini dapat menjujukkan DNA dengan tepat? Untuk arkib berita mengenai alat ini sila klik di sini.
Rujukan
1) http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_sequencing diambil pada 1/06/2015
2) Pusat Rujukan Persuratan Melayu (PRPM), http://prpm.dbp.gov.my/Default.aspx diambil pada 2/06/2015
Daftar istilah
[1] DNA - Asid deoksiribonukleik asid, juzuk utama yang membentuk bahan genetik (bahan penentu ciri-ciri kebakaan) kebanyakan organisma hidup, termasuk sesetengah virus yang terkandung dalam nukleus sel organisma yang berkenaan.
[2] Penjujukan - kemampuan peranti penghantaran untuk menyusun data atau isyarat dalam satu siri yang bersambung tanpa bantuan langsung manusia.
[3] Genom - (English:Genome) turutan DNA lengkap bagi satu set kromosom. Istilah genom boleh digunakan secara khusus bagi maksud set lengkap DNA nukleus dan juga bagi organel yang mengandungi DNA-nya sendiri.
[4] Kromatografi - kaedah untuk memisahkan komponen sesuatu bahan atau campuran, iaitu dengan memasukkannya ke dalam larutan dan didasarkan pada perbezaan sifat berpindah komponen tersebut melalui sesuatu medium, iaitu komponen bergerak pada kadar yang berlainan.
[5] Fluorescence - (Istilah sasar: pendafluor) sifat bahan yang memancarkan cahaya tampak sebagai tindakbalas daripada pendedahan sinaran sumber lain. Cahaya yang dipancarkan mempunyai panjang gelombang yang lebih panjang dibandingkan dengan sinaran pengujaan.
[6] Operon - (operon: merujuk kepada 'operate' bermaksud 'pengendali', secara umumnya terkandung dalam bakteria atau sel prokaryotik - pent.) sebahagian DNA yang mengandungi satu gen operator, kadang-kadang satu gen resepsor dan beberapa gen struktur, yang bertindak atau berfungsi sebagai satu struktur. [Sejarah: Operon ditemui oleh saintis Perancis Jacob, Lwoff dan Monod pada tahun 1960-an] Contoh: ~ lac Operon dalam Escherichia coli yang berfungsi mengendalikan penguraian lakstosa. [Nota tambahan: operon mempunyai ciri-ciri ini, PROG, atau Promoter, Repressor, Operator, Gene]
[7] Nukleotida - unit asas nukleik yang sebahagiannya koenzim penting.
[8] RNA - Asid ribonukleik
[9] Archaea - Kingdom bagi mikroorganisma sel tunggal. -pent.
[10] Fenotip - (English: Phenotype) ciri fizikal keseluruhan yang dizahirkan oleh sesuatu organisma yang ditentukan oleh saling tindak antara genotip dengan persekitarannya.
[11] PCR - (English: Polymerase Chain Reaction) Tindakbalas rantai polymerase, kaedah memperbanyak atau mereplikasi DNA secara pemangkinan. -pent.
.jpg)