Diterjemahkan oleh Ibadurrahman
Allan M. Maxam dan Walter Gilbert
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Universiti Harvard, Cambridge, Massachusetts 02138
Disumbangkan oleh Walter Gilbert, 9 Disember 1976.
ABSTRAK
DNA dapat dijujukkan melalui suatu prosedur kimia yang mematahkan separa molekul DNA terlabel pada tiap-tiap pengulangan sesuatu bes. Ukuran panjang fragmen yang telah dilabel kemudiannya menentukan kedudukan bes berkenaan. Kami menerangkan tindakbalas yang membelah DNA secara yang diingini pada guanin, adenin, cytosine dan thymine sama banyak dan pada cytosine semata-mata. Apabila produk keempat-empat tindakbalas ini ditentukan berdasarkan saiz melalui elektroforesis pada gel acrylamide, urutan DNA dapat dibaca menerusi bentuk garis-garis radioaktif. Teknik tersebut membolehkan penjujukan sekurang-kurangnya 100 bes bermula dari titik pelabelan.
...
Kami telah membangunkan kaedah baharu bagi menjujukkan molekul DNA. Prosedurnya menentukan nukleotida molekul DNA yang berhujung-terlabel dengan memecahkannya pada adenine, guanine, cytosine, atau thymine menggunakan agen kimia. Pembelahan separa pada tiap-tiap bes menghasilkan set sesarang fragmen radioaktif menjangkaui dari hujung berlabel kepada tiap-tiap posisi bes tersebut. Elektroforesis gel acrylamide menyelesaikan bebenang-bebenang tunggal ini saiz-saiznya didedahkan dalam susunan titik pembelahan. Autoradiograf gel yang terhasil dari keempat-empat pembelahan kimia yang berbeza, tiap satunya spesifik untuk satu bes akan kami terangkan, yang kemudiannya menunjukkan suatu gayabentuk garisan-garisan yang padanya dapatlah dibaca secara langsung. Kaedah ini terhad hanya dengan adanya kekuatan pada gel acrylamide; dalam keadaan untuk masa ini, kami boleh jujukkan ke hadapan lebih kurang 100 bes dari hujung pada mana-mana fragmen DNA yang telah dilabel.
Kami mensasarkan DNA dengan reagen yang mana akan mula-mula memunahkan dan membuang suatu bes dari kumpulan gulanya. Gula yang terdedah sekarang telah menjadi suatu titik lemah dalam tulangbelakang binaan berkenaan dan sangat mudah untuk runtuh; suatu alkali atau siri pemangkinan amine tindakbalas penyingkiran-β akan membelah gula tersebut sepenuhnya daripada 3' dan 5' fosfatnya. Tindakbalas tersebut bersama bes-bes adalah terhad, hanya memusnahkan 1 residue untuk setiap 50 ke 100 bes di sepanjang DNA itu. Tindakbalas kedua untuk membelah bebenang DNA mestilah sampai kepada penghabisan, supaya molekul akhir untuk di analisis tidak memiliki imej yang terselindung. Reagen khusus-purine adalah dimethyl sulfate, reagen khusus-pyrimidine adalah hydrazine.
Penjujukan ini memerlukan molekul DNA, sama ada bebenang-tunggal atau dwi-bebenang yang dilabel pada salah satu hujung bebenang dengan 32P (radio-isotop fosforus). Boleh sahaja sama ada label pada 5' atau 3'. Fragmen restriksi sebarang ukuran panjang dilabel pada kedua-dua hujung-sebagai contoh, ianya dirawat terlebih dahulu dengan alkaline phosphatase untuk menyingkirkan fosfat terminal dan kemudiannya dilabel dengan 32P dengan cara memindahkan dari ATP berlabel-γ dengan polynucleotide kinase. Berikutnya, terdapat dua pilihan strategi: sama ada (i) molekul dwi-bebenang tersebut dipotong oleh enzim restriksi kedua dan kedua-dua hujungnya dilarutkan ke dalam gel acrylamide dan diasingkan lantas dijujukkan atau (ii) molekul dwi-label berkenaan dinyahaslikan dan bebenang-bebenang berkenaan dipisah-pisahkan di dalam gel[1], diekstrak, dan dijujukkan.
KIMIA YANG KHUSUS
Pembelahan Guanine/Adenine [2]. Dimethyl sulfate memetilkan (menambah kumpulan metil -CH3) pada guanine di dalam DNA pada kedudukan N7 dan posisi N3 pada adenine[3]. Ikatan glikosidik pada purine adalah tidak stabil [3,4] dan mudah terpecah akibat haba pada pH neutral, lalu membebaskan gula. Rawatan dengan 0.1M alkali pada 90'C kemudiannya akan membelah gula berkenaan daripada kumpulan fosforus yang bersebelahan. Apabila fragmen hujung-terlabel dipecahkan di dalam gel polyacrylamide, autoradiograf mengandungi garis-garis gelap dan nipis. Garis-garis gelap ini muncul akibat pemecahan berlaku pada guanine yang mana di-metilkan 5 kali lebih pantas dari adenine[3].
Bentuk paten guanine yang kuat/adenine yang lemah ini sudah memiliki hampir separuh maklumat yang diperlukan bagi penjujukan, walaubagaimanapun, ambiguiti (kesamaran atau ketidaktentuan yang memungkin dua tafsiran dibuat) boleh timbul tatkala mengintrepertasi paten ini kerana keamatan garis yang terpisah adalah sukar untuk ditaksirkan. Bagi menentukan bes-bes tersebut kami bandingkan maklumat yang terdapat dalam kolum gel ini dengan kolum yang selari di mana pemecahan guanine di ditahan, menyebabkan adenine dibiarkan dan jelas kelihatan.
Pembelahan Adenine yang telah dipertingkatkan. Ikatan glikosidik adenosine yang telah dimetilkan adalah kurang stabil berbanding guanosine yang telah dimetilkan[4]; maka, rawatan lembut dengan menggunakan asid cair membebaskan adenine sebagaimana ianya. Pembelahan berikutnya dengan alkali menghasilkan suatu paten garisan gelap menunjukkan adenine dengan garis cerah pada guanine.
Pembelahan pada Cytosine dan Thymines. Hydrazine bertindakbalas dengan thymine dan cytosine, membelah bes berkenaan dan meninggalkan ribosylurea[5-7]. Hydrazine mungkin sekali kemudiannya bertindakbalas untuk menghasilkan hydrazone[5]. Setelah hydrazlinolysis separa berlaku dalam 15-18 M aqueous hydrazine 20', DNA dibelah dengan 0.5M piperidine. Amine putar sekunder ini, sebagai bes bebas, menggantikan kesemua hasil tindakbalas hydrazine dengan gula dan memangkinkan proses penyingkiran-β fosfat. Paten akhir mengandungi garis-garis yang memiliki keamatan yang sama daripada belahan pada cytosine dan thymine.
Pembelahan pada cytosine. Kehadiran 2M NaCl menegah tindakbalas thymine dengan hydrazine. Kemudian, pemecahan peperidine menghasilkan garis-garis yang dari cytosine.
SEBUAH MISAL
Pertimbangkan sebuah fragmen DNA 64-pasang-bes, dipotong dari DNA lac operon (rujuk daftar istilah nombor [6] dalam pautan ini) oleh enzim Alu I, enzim dari Arthrobacter luteus, yang mana memotong habis pada urutan AGCT diantara G dengan C[8]. Selepas proses fosforilasi, dua hujung 5'-nya dilabel dengan 32P. Autoradiograf didalam Rajah 1 menunjukkan dua bebenang berpisah sewaktu elektroforesis, selepas ternyahasli, di dalam gel acrylamide neutral,(1) ianya menjadi mudah diekstrak, Bagi setiap bebenang, alikuot (sedikit bahagian dari cecair -pent.) 4 tindakbalas pembelahan (G kuat/ A lemah, A kuat, C kuat dan C+T) di elektroforesiskan pada 600-1000 V dalam sebuah 40-cm 20% polyacrylamide/7 M gel urea. 12 jam kemudiannya, bahagian kedua setiap sampel dimuatkan ke dalam gel dan elektroforesis diteruskan. Rajah 2 menunjukkan autoradiograf memaparkan dua kawasan urutan setiap bebenang diambil dari satu gel ini: satu yang hampir dengan hujung terlabel dalam sampel itu yang telah dielektroforesis dalam jangka masa singkat, dan satu kawasan lebih jauh ke dalam molekul, dijarakkan oleh elektroforesis dalam jangka masa panjang. Urutannya adalah mudah untuk dibaca berdasarkan paten garis-garis. Jarak antara fragmen-fragmen semakin mengecil dari bawah menghala ke atas gel tersebut. Perbezaan dan kepelbagaian kecil pada jarak adalah spesifik-urutan dan mengisyaratkan nukleotida akhir yang ditambah, sebuah T atau G, pergerakan yang menurun lebih dari A atau T.
Fragmen pada hujung gel tersebut dengan bes yang hampir sekali dengan yang telah dimusnahkan oleh sasaran kimia; label-label pada garisan di dalam rajah menunjukkan bes-bes yang telah disasar. Dalam Rajah 2, 62 bes boleh dibaca untuk kedua-dua bebenang, 2 bes terakhir pada dua hujung 5' tidak ditentukan oleh gel ini. Urutan setiap bebenang adalah konsisten dan dipastikan susunan seperti ini:
Kami mensasarkan DNA dengan reagen yang mana akan mula-mula memunahkan dan membuang suatu bes dari kumpulan gulanya. Gula yang terdedah sekarang telah menjadi suatu titik lemah dalam tulangbelakang binaan berkenaan dan sangat mudah untuk runtuh; suatu alkali atau siri pemangkinan amine tindakbalas penyingkiran-β akan membelah gula tersebut sepenuhnya daripada 3' dan 5' fosfatnya. Tindakbalas tersebut bersama bes-bes adalah terhad, hanya memusnahkan 1 residue untuk setiap 50 ke 100 bes di sepanjang DNA itu. Tindakbalas kedua untuk membelah bebenang DNA mestilah sampai kepada penghabisan, supaya molekul akhir untuk di analisis tidak memiliki imej yang terselindung. Reagen khusus-purine adalah dimethyl sulfate, reagen khusus-pyrimidine adalah hydrazine.
Penjujukan ini memerlukan molekul DNA, sama ada bebenang-tunggal atau dwi-bebenang yang dilabel pada salah satu hujung bebenang dengan 32P (radio-isotop fosforus). Boleh sahaja sama ada label pada 5' atau 3'. Fragmen restriksi sebarang ukuran panjang dilabel pada kedua-dua hujung-sebagai contoh, ianya dirawat terlebih dahulu dengan alkaline phosphatase untuk menyingkirkan fosfat terminal dan kemudiannya dilabel dengan 32P dengan cara memindahkan dari ATP berlabel-γ dengan polynucleotide kinase. Berikutnya, terdapat dua pilihan strategi: sama ada (i) molekul dwi-bebenang tersebut dipotong oleh enzim restriksi kedua dan kedua-dua hujungnya dilarutkan ke dalam gel acrylamide dan diasingkan lantas dijujukkan atau (ii) molekul dwi-label berkenaan dinyahaslikan dan bebenang-bebenang berkenaan dipisah-pisahkan di dalam gel[1], diekstrak, dan dijujukkan.
KIMIA YANG KHUSUS
Pembelahan Guanine/Adenine [2]. Dimethyl sulfate memetilkan (menambah kumpulan metil -CH3) pada guanine di dalam DNA pada kedudukan N7 dan posisi N3 pada adenine[3]. Ikatan glikosidik pada purine adalah tidak stabil [3,4] dan mudah terpecah akibat haba pada pH neutral, lalu membebaskan gula. Rawatan dengan 0.1M alkali pada 90'C kemudiannya akan membelah gula berkenaan daripada kumpulan fosforus yang bersebelahan. Apabila fragmen hujung-terlabel dipecahkan di dalam gel polyacrylamide, autoradiograf mengandungi garis-garis gelap dan nipis. Garis-garis gelap ini muncul akibat pemecahan berlaku pada guanine yang mana di-metilkan 5 kali lebih pantas dari adenine[3].
Bentuk paten guanine yang kuat/adenine yang lemah ini sudah memiliki hampir separuh maklumat yang diperlukan bagi penjujukan, walaubagaimanapun, ambiguiti (kesamaran atau ketidaktentuan yang memungkin dua tafsiran dibuat) boleh timbul tatkala mengintrepertasi paten ini kerana keamatan garis yang terpisah adalah sukar untuk ditaksirkan. Bagi menentukan bes-bes tersebut kami bandingkan maklumat yang terdapat dalam kolum gel ini dengan kolum yang selari di mana pemecahan guanine di ditahan, menyebabkan adenine dibiarkan dan jelas kelihatan.
Pembelahan Adenine yang telah dipertingkatkan. Ikatan glikosidik adenosine yang telah dimetilkan adalah kurang stabil berbanding guanosine yang telah dimetilkan[4]; maka, rawatan lembut dengan menggunakan asid cair membebaskan adenine sebagaimana ianya. Pembelahan berikutnya dengan alkali menghasilkan suatu paten garisan gelap menunjukkan adenine dengan garis cerah pada guanine.
Pembelahan pada Cytosine dan Thymines. Hydrazine bertindakbalas dengan thymine dan cytosine, membelah bes berkenaan dan meninggalkan ribosylurea[5-7]. Hydrazine mungkin sekali kemudiannya bertindakbalas untuk menghasilkan hydrazone[5]. Setelah hydrazlinolysis separa berlaku dalam 15-18 M aqueous hydrazine 20', DNA dibelah dengan 0.5M piperidine. Amine putar sekunder ini, sebagai bes bebas, menggantikan kesemua hasil tindakbalas hydrazine dengan gula dan memangkinkan proses penyingkiran-β fosfat. Paten akhir mengandungi garis-garis yang memiliki keamatan yang sama daripada belahan pada cytosine dan thymine.
Pembelahan pada cytosine. Kehadiran 2M NaCl menegah tindakbalas thymine dengan hydrazine. Kemudian, pemecahan peperidine menghasilkan garis-garis yang dari cytosine.
SEBUAH MISAL
Pertimbangkan sebuah fragmen DNA 64-pasang-bes, dipotong dari DNA lac operon (rujuk daftar istilah nombor [6] dalam pautan ini) oleh enzim Alu I, enzim dari Arthrobacter luteus, yang mana memotong habis pada urutan AGCT diantara G dengan C[8]. Selepas proses fosforilasi, dua hujung 5'-nya dilabel dengan 32P. Autoradiograf didalam Rajah 1 menunjukkan dua bebenang berpisah sewaktu elektroforesis, selepas ternyahasli, di dalam gel acrylamide neutral,(1) ianya menjadi mudah diekstrak, Bagi setiap bebenang, alikuot (sedikit bahagian dari cecair -pent.) 4 tindakbalas pembelahan (G kuat/ A lemah, A kuat, C kuat dan C+T) di elektroforesiskan pada 600-1000 V dalam sebuah 40-cm 20% polyacrylamide/7 M gel urea. 12 jam kemudiannya, bahagian kedua setiap sampel dimuatkan ke dalam gel dan elektroforesis diteruskan. Rajah 2 menunjukkan autoradiograf memaparkan dua kawasan urutan setiap bebenang diambil dari satu gel ini: satu yang hampir dengan hujung terlabel dalam sampel itu yang telah dielektroforesis dalam jangka masa singkat, dan satu kawasan lebih jauh ke dalam molekul, dijarakkan oleh elektroforesis dalam jangka masa panjang. Urutannya adalah mudah untuk dibaca berdasarkan paten garis-garis. Jarak antara fragmen-fragmen semakin mengecil dari bawah menghala ke atas gel tersebut. Perbezaan dan kepelbagaian kecil pada jarak adalah spesifik-urutan dan mengisyaratkan nukleotida akhir yang ditambah, sebuah T atau G, pergerakan yang menurun lebih dari A atau T.
 |
Rajah 1 Pengasingan bebenang sesuatu fragmen restriksi: 1.5µg sebuah fragmen DNA 64-pasang-bes (75pmol hujung 5') difosforilasikan dengan [ γ-32]ATP (800 ci/mmol) dan polynucleotide kinase, dinyahasli dalam alkali, dilapiskan ke dalam sebuah permukaan 0.3 cm x 3 cm 8% gel acrylamide , dielektroforesiskan pada 200V (dikawal) dan 20 mA (purata), sehingga pewarna xylene claynol (XC) bergerak sejauh 9 cm. Gel berkenaan pada plat kaca kemudiannya dilitup ketat dengan Saran Wrap dan didedahkan kepada filem Kodak XR-5 sinar-x selama 10 minit.
|
Fragmen pada hujung gel tersebut dengan bes yang hampir sekali dengan yang telah dimusnahkan oleh sasaran kimia; label-label pada garisan di dalam rajah menunjukkan bes-bes yang telah disasar. Dalam Rajah 2, 62 bes boleh dibaca untuk kedua-dua bebenang, 2 bes terakhir pada dua hujung 5' tidak ditentukan oleh gel ini. Urutan setiap bebenang adalah konsisten dan dipastikan susunan seperti ini:
Tiada ulasan:
Catat Ulasan